與光 散射、滲透 壓、超離心 ( 蔗糖密 度梯度離 心 )及 層析方 法 ( 凝膠過 濾 )相比, 用 S D s 聚丙 烯酸 胺凝 膠 電泳 分離 蛋 白質(zhì)亞 基并測(cè) 定它 們的分子 量, 可 以避 免使 用昂貴的儀 器和 分離介質(zhì), 所以是一 個(gè)既 快又經(jīng) 濟(jì)又 比 較 精 確 的 方法.s D S 電泳過去 大部分 用管狀 或垂 直板狀 凝膠 來進(jìn) 行使 用圓盤 電泳時(shí), 標(biāo)準(zhǔn)與 未知 蛋 白不 能加 在 同一管凝 膠 中, 因而 難 以精確測(cè) 定分子 量. 使 用垂直平 板 電泳, 雖 然克服 了 以上缺點(diǎn), 但一塊膠通常 只 能分析 6一 10 個(gè) 樣品, 且膠層 厚 (一 般為 Zm m ),分 辨率低. 干 燥時(shí), 由于凝 膠收 縮而 導(dǎo)致分 子量測(cè)定 的誤 差.
s D S 電泳如果在 水平 薄層凝 膠 中進(jìn)行, 這 樣不 僅一塊膠可 以分 析幾 十個(gè) 樣品, 便于在相 同 條件下與 標(biāo)準(zhǔn) 比較 可得 到精 確的數(shù) 據(jù), 而 且 膠 層 薄 (.0 ,m m ), 電泳時(shí) 間短, 分辨率高. 再則薄 層膠 電泳 后便于干 燥保 存 ( 只要 在甘 油溶液 中浸 飽一定時(shí) 間后, 在室 溫下 自然干燥, 不 需要凝 膠干 燥器 ).水 平薄 層 S D S 電泳 的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn) 是便 于作為雙 向 電泳的 第二 向.
S D S 電泳的原理S D S 電泳技術(shù)首 先 在 1 9 6 7 年 由 S ha Pir o建 立,2 9 6 9 年由 Webe r 和 osbo r n 進(jìn) 一步 完善. 他們發(fā) 現(xiàn), 在樣 品介 質(zhì)和聚丙 烯酞 胺凝 膠系統(tǒng) 中加人 十二 烷基 硫酸鈉 (s od iu m dode e y l,ul afte,s D s) 后, 則蛋 白質(zhì)分子的 電泳遷 移率主要取決 于它 的分子 量大 小, 其它 因素可 以忽略不 計(jì). 、s D s 是 一種 陰離 子去 污劑, 它 能破壞 蛋 白質(zhì)分 子之 間以及 與其 它物質(zhì)分子 之間 的非共價(jià)鍵. 在強(qiáng) 還原 劑例 如硫基 乙醇或 二硫 蘇搪醇 的存在 下, 蛋 白質(zhì)分子 內(nèi)的 二硫鍵被 打開 并解 聚成組成 它 們的 多膚鏈.解聚后 的蛋 白質(zhì)分子 與S D S 充 分結(jié)合形成 帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)一S D S 復(fù)合物. 復(fù)合物 所帶 的 S D S 負(fù)電荷大大 超過 了蛋 白質(zhì)分子原 有的電荷量, 這就 消除 了不 同種類蛋 白質(zhì)分 子之 間原有 的 電荷 差 異, 蛋 白 質(zhì)-s D s 復(fù)合物在水溶 液 中的形 狀像 一 個(gè) 長(zhǎng) 橢 圓棒. 橢 圓棒的短軸對(duì)不 同的蛋 白質(zhì) 亞 基一S D S復(fù)合物基本上 是相 同的, 約 為 18 入。 但 長(zhǎng)軸 的長(zhǎng)度 則與 蛋 白質(zhì)分子量的大 小成正 比, 因此 這種 復(fù)合物 在 S D S一 聚丙 烯酞胺凝膠系 統(tǒng)中 的電泳 遷移 率不再 受蛋 白質(zhì)原有電荷 的影 響, 而 主要取決于橢 圓棒的長(zhǎng) 軸長(zhǎng)度即蛋 白質(zhì)及其亞基分 子量的大小. 當(dāng)?shù)?白質(zhì) 的分子量在 1 50 0 到2 0 0 0 0 0 之間時(shí), 電泳 遷移 率與 分子量的 對(duì)數(shù)呈線 性關(guān)系.fo g M W ~ 一 b·m 左 + K式中, M w 為 蛋 白質(zhì)的 分子 量, m R 為相 對(duì)遷 移率,b 為 斜率, K 為 截距, 在 條件一定時(shí),b 和 K均為常數(shù).由此可 見,S D S 電泳不僅可 以分離蛋 白質(zhì), 而且 可 以根 據(jù) 遷移 率大小 測(cè) 定蛋 白質(zhì)亞基 的分 子量。 這個(gè)規(guī)律對(duì)大部分蛋 白質(zhì)是適用 的, 只 有少 數(shù)蛋 白質(zhì)例外.均勻凝膠 的配方.衰 1 凝膠濃度與分子 t 測(cè)定的 關(guān)系凝膠濃度 交 聯(lián) 度5%1 0%1 5%2.6%2。6%2.6%表 2 S D S 聚丙 烯酞 胺 均勻膠的 配方凝膠的 濃度 T 與交聯(lián)度 C溶液 T ~ 5.1%,C ~ 2.6 %T ~ 7.5%,C = 2.6%2%6呱S D S 聚丙 烯酞胺凝膠的組 成與聚合水平薄 層 S D S 聚丙 烯酸 胺凝膠 電泳 可使用均 勻膠 也可 使 用梯度 膠. 前 者制膠 比較簡(jiǎn)便, 后 者制 膠 比較復(fù) 雜, 但 由于聚丙 烯酞 胺濃度梯 度在電泳 分離時(shí)起 到 了分子篩 的作用, 使 分辨 率大 大提 高.適合于復(fù)雜成 分 的樣品 分析.凝 膠 的性 質(zhì)對(duì)能 否得到 分子量與相對(duì)遷移率的 線性關(guān)系是 非常重要 的. 丙 烯酸胺 的不純會(huì) 影 響凝 膠 的聚合 以及 譜帶 的分離, 出現(xiàn)拖 尾現(xiàn)象.凝 膠的 聚合常 采 用化 學(xué)聚 合, 即用 適量的 過硫酸銥作 為催 化劑, 四 甲基 乙二 胺作為 加速 劑.為 了保 證 電泳時(shí)得 到 最佳分離 效果, 應(yīng)盡 可能減 少過 硫酸按和 四 甲基 乙二胺 的量, 使聚 合大 約在 40 m in 到 h1 左右 完成 田.聚 合太慢 或聚合不充 分會(huì) 使 電泳 帶畸變.聚合太快,過 量的 過硫酸胺 或四 甲基 乙二胺 會(huì)影 響樣 品的分 離, 且 凝膠 在干 燥保 存時(shí) 會(huì)發(fā) 生龜 裂. 為 此,聚合時(shí) 溫度 宜在 30 一 50 ℃.制 好的凝 膠要 在室溫下 放置 1 h2 再 使 用, 以使凝 膠充分 聚合. 不能放在 冰箱中, 以防 S D S 在凝膠 中結(jié)晶.自制的 s D s 凝 膠在保 濕盒 中可 保存四天 左右.凝膠濃 度 的選擇 取決 于被分 離的 蛋 白質(zhì) 的分子 量. 如果 采 用均勻 膠, Weber 的實(shí) 驗(yàn)指出, 在 以下 濃度 時(shí), 分 子量 的對(duì)數(shù)與 電泳遷移 率呈直線 關(guān)系, 見 表 1。
.表 2 為 S D S 聚 丙烯酸 胺均勻 凝膠 的配方.使用 均勻 濃度 的 S D s 聚丙 烯酸胺凝 膠來分析 測(cè)定 分子 量 范圍很寬的 蛋 白 質(zhì) 是 有 困 難的.特 別是 低 分 子 量 的 點(diǎn) 容 易偏 離 直 線.D u nke r 和 R u e e ke r t 指 出,1 0 多 的膠 可分析 的最 小分 子量為 l 萬(wàn).5 外 的膠可 分析 最小 分 子量為 2 萬(wàn)。 為了 分析寬 范圍的 分子量的 樣品,并提高 分辨 率, 必 須使 用 S D S 聚丙 烯酸 胺梯度凝 膠.聚丙 烯酞胺凝 膠濃度梯度 的選擇應(yīng)根據(jù)樣品成 分 的分子 量 范圍. 如梯 度 8一 25 適 合 于分子 量范圍為 1 0 0 0 0 到 3 0 0 0 0 0 的樣 品. 梯度1 0一 15 適 合于 1 0 0 0 0 到 2 5 0 0 0 0 的樣品.梯 度4一 1 5 適合 于 3 0 0 0 0 到 3 0 0 0 0 0 的樣品.1 9 8 0 年 G 6r g 等`,,,,介紹 7 用水平薄 層 聚丙 烯酸胺 小孔梯度凝 膠作 S D s 電泳. 由于膠層薄 (。.s m m ), 冷卻 效果 好, 能使用高 場(chǎng)強(qiáng), 因此分辨率高, 分離時(shí) 間短, 且 由于膠 層薄, 染 色、 做 薄層 小孔 梯度凝膠 的配方. 梯度的線 性情況脫 色、保 存都比較容 易。 表 3 為 使 用 P h ar m ac ia 可 在凝 膠 中加 人一點(diǎn) 澳酚藍(lán)后 用光密度計(jì)掃 描LK B 公 司 的梯度混合器 和梯度凝膠 模 具 來 制 來檢查緩沖液與緩沖液凝膠 條與等 電聚 焦技術(shù) 相反, 緩沖 液是 S D S 電泳分離系統(tǒng) 中很 重要 的介質(zhì). 一 般來說,’在 蛋 白質(zhì)穩(wěn) 定的 p H 范圍, 凡不 與 s D s 發(fā)生 相互作 用的 緩沖液 都可 以使 用, 但緩沖液 的選 擇對(duì) 蛋 白帶 的分離和 電 泳的速 度是 非常關(guān)鍵的.在 s D s 電泳系統(tǒng) 中需要使用樣品 緩沖 液,凝膠 緩沖 液 以及電極 緩沖 液.樣 品緩 沖液與 凝膠 緩沖液常 采 用同一 種系統(tǒng). 系 統(tǒng)的 選擇主 要考 慮對(duì) 蛋 白質(zhì)樣 品的 穩(wěn)定性 和溶 解性 的 影 響.
樣 品 緩沖液的離 子強(qiáng) 度一般低 于 凝 膠 緩 沖 液(如十 分之一 ), 但 s D S 的含量應(yīng) 高于凝 膠緩 沖液. 電極 緩 沖液可 以采用 相同 的緩沖 系統(tǒng)也 可以 采用不 同 的緩沖 系統(tǒng)。
它 主要影 響 電 泳 速度. 如磷 酸緩 沖系 統(tǒng) 由于它 的高 導(dǎo)電性, 只 能使用低場(chǎng) 強(qiáng), 所需的 電泳時(shí) 間是使 用咪 哇緩沖液 的一倍.電極 緩沖 液一般 只 能使用 四 五 次.
多 次使用會(huì)影 響 電泳 結(jié)果與 電泳 速度. 用后 的 電極 緩沖液 由于陽(yáng)、 陰離子 各 自向負(fù)、正 電極 移動(dòng), 所以再行使 用時(shí)要混合陽(yáng)、 陰極緩沖液, 然后再 分長(zhǎng) 期 以來一 直使 用電極 緩沖液和 搭紙橋進(jìn)行 S D S 電泳, 由于 需要經(jīng)常 配置大 量 的緩沖液 給實(shí)驗(yàn) 帶來很 多麻煩.近 幾 年 P h ar m ac iaL K B 公司推 出了 一種新 技術(shù), 用凝膠 條來 代替緩沖 液和 濾紙橋.緩沖 液凝膠 條是 用不 同 緩沖液配 制的聚 丙 烯酞胺 凝膠或 瓊 脂 精 凝 膠 制 成的. 電泳時(shí)將凝 膠條放在 凝膠 表面上與 電極接觸便可 以 了.使 用凝膠條不僅 不需要再配 置緩沖 液和 搭紙橋, 而 且可 以大 大 縮短 電 泳 時(shí) 間.使 用 電極 緩 沖液時(shí),S D s 電泳 一 般 需 要 2一4小 時(shí). 但使用凝膠 條只要 h1 左右, 浪酚 藍(lán)便 可以到達(dá)前沿.