2016 年底，國家衛生和計劃生育委員會發布了最新版《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》(GB5009.6－2016) ［1］ ，該標準整合并替代了 GB/T 5009.6－2003 ［2］ 、GB/T 9695.1－2008 ［3］ 、GB 5413.3－2010 ［4］ 、GB/T 9695.7 － 2008 ［5］ 、GB/T 14772 － 2008 ［6］ 、GB/T5512－2008 ［7］ 、GB/T 15674－2009 ［8］ 、GB/T 22427.3－2008 ［9］ 、GB/T 10359－2008 ［10］ 等 9 個食品及相關產品中脂肪檢測的國家標準。該標準適用于水果、蔬菜及其制品、糧食及糧食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品和嬰幼兒配方食品等產品中脂肪的測定。
該標準為食品中脂肪含量測定通用國家標準，為食品生產企業內部質控、檢驗檢測機構和監管機構依法檢測判定提供了標準依據。但是食品種類紛繁復雜，脂肪存在形式多樣，脂肪檢測常用的四種方法其原理依據也各不相同，所以通用性檢測標準可能存在選擇性差的缺點
［11－15］ 。GB 5009.6－2016 標準僅說明了其與 GB/T 5009.3－2003 標準的差異，而沒有比較其與被其替代的其他標準的不同之處，其中不乏部分重要的解釋說明或限定的測試條件。所以本文就 GB 5009.6－2016 標準的檢測原理、適用范圍、與被其替代標準的差異等方面進行解讀和分析，并對標準文本中未提到、或解釋不全的技術要素進行了分析探討，讓檢測人員知其然亦知其所以然，以提高檢測效率。
1 檢測原理
GB 5009.6－2016 標準所列的索氏提取法、酸水解法和堿水解法的基本過程，都是用有機溶劑提取脂肪，然后通過蒸發去除有機溶劑，干燥后最后測得脂肪含量。索氏提取法［16－17］ 中一般以乙醚作為提取劑，提取的物質除中性脂肪外，還有游離脂肪酸、蠟、磷脂、固醇及色素等脂溶性物質，故提出物只能稱為粗脂肪。索氏提取是有機物提取常用且提取率較高的方法，但是由于乙醚不能充分滲入樣品顆粒內部，或由于脂類與蛋白質或碳水化合物形成結合脂，特別是對于容易吸潮、結塊、難以烘干的食品，用索式抽提法并不能將其中的脂類完全提取出來。酸水解法［18－19］ 可與索氏提取法結合，以提取產品中不同存在方式的脂肪［20－21］ 。酸水解法(包括巴布科克法)和堿水解法(又稱羅紫－哥特里(Ｒose－Gottlieb)法)的原理相似:用酸或堿分解非脂肪組分，再用有機溶劑萃取，得游離態脂肪和結合態脂肪之和即總脂肪含量。但是酸水解法不適用于高糖或高磷脂樣品的處理，因為在熱強酸條件下，糖類易碳化，磷脂易分解為脂肪酸和堿［22］ 。
表 1 脂肪檢測方法基本情況比較分析Table 1 Comparison and analysis of the basic situation of fat detection methods方法名稱 測定參數 適用范圍 不適用情況 過程及結果評價索氏提取法 游離態脂肪一般食品:脂肪含量較高，含結合態脂肪較少，能烘干磨細，不易吸潮結塊的樣品。結合態脂肪 耗時長易偏低酸水解法
游離態及結合態 脂 肪 或 總脂肪某些食品，其所含脂肪包含于組織內部，如淀粉及其焙烤制品(面條、面包之類)，由于乙醚不能充分滲入樣品顆粒內部，或由于脂類與蛋白質或碳水化合物形成結合脂，特別是容易吸潮、結塊、難以烘干的食品。
高磷脂或高糖食 品，如 魚 貝蛋等固體樣品前處理及索氏提取繁瑣，易碳化或分解而偏低堿水解法游離態及結合態 脂 肪 或 總脂肪巴氏殺菌乳、滅菌乳、生乳、發酵乳、調制乳、乳粉、煉乳、奶油、稀奶油、干酪和嬰幼兒配方食。除上述乳制品外，還適用于豆乳或加水顯乳狀的食品。非乳狀食品國際通用乳及乳制品檢測方法 ［17］
蓋勃法
游離態及結合態 脂 肪 或 總脂肪巴氏殺菌乳、滅菌乳、生乳。高糖或高磷脂食品及非乳狀食品精確度低，易碳化或分解而偏低GB 5009.6－2016 標準在酸水解法中對肉制品和淀粉的前處理做了特殊規定，所以酸水解法理應適用于肉制品、淀粉的總脂肪或脂肪含量測定，但是標準并未對含淀粉食品是否也可以用酸水解法來檢測進行說明，而王毅等［19］ 的研究表明，含淀粉且高糖類的食品，如中式糕點，則不適合用酸水解法檢測。非乳制品脂肪測定應當以索氏提取法為基礎，了解食品中脂肪存在的主要形式，除高磷脂或高糖的情況，其余均可以考慮同時用酸水解法。乳及乳制品則以堿水解法為仲裁方法，蓋勃法為補充。李鵬等［23－24］ 的研究表明，在 GB 5009.6－2016 標準中未被采用的氯仿－甲醇法，適用于含結合態酯類比較高，特別是磷脂含量高的樣品，如鮮魚、貝類、肉、禽、蛋等，對于含水量高的樣品則更為有效。
2 標準方法適用情況
被 GB 5009.6－2016 標準替代的 9 個標準中，明確規定測定參數為粗脂肪的有 4 個標準、游離脂肪的有 1 個標準、總脂肪的有 3 個標準。所以在應用GB 5009.6－2016 標準時，需要對測定參數和檢測范圍進行再確認。GB 5009.6－2016 標準中脂肪檢測方法基本情況見表 1。
3 檢測方法差異及分析
3.1 試樣前處理
3.1.1 干燥助劑或碾磨助劑 GB 5009.6－2016 標準對于固體樣品前處理過程，沒有提出需要添加干燥助劑或碾磨助劑，而多個被替代標準中均提出，樣品前處理時需加入干燥助劑或碾磨助劑［16］ (海沙、石英砂、無水硫酸鈉、硅藻土等)，因為干燥助劑(組織疏松劑)可以用于水分含量較大、粘稠度高的樣品，提高干燥程序，有利于前處理過程。對于某些難于磨碎的樣品，如糧食、油料餅粕等，加入適量的碾磨助劑，可以協助碾磨，也可以降低溫度，以免脂肪在溫度過高時氧化。另外，加入的助劑還需具有一定的吸附能力，當油脂由于碾磨過度溶出較多時，不至于被容器吸附或揮發，而是被吸附在助劑中，因此，被替代標準［2，6－8，10］ 中均要求將助劑及擦拭器皿的擦拭紙轉移至萃取裝置中，防止脂肪過度溶出損失。
3.1.2 萃取前干燥處理 索氏提取法使用有機溶劑抽提，適用于干燥而分散的樣品。當使用乙醚作為提取劑時，乙醚中 1.5% ～2% 水分能夠使樣品中的非脂類水溶性物質隨著脂肪一同被提取出來，從而增加測試結果的正誤差［25］ 。在舊版的 5 個標準中均在抽提前對樣品進行了去水操作，例如肉類［3］ 和食用菌［8］ 需在(103 ±2) ℃溫度下干燥30～60 min;中式糕點和西式糕點需分別在(103 ±2) ℃和(90 ±2) ℃溫度下干燥 2 h ［6］ ; 糧食 ［7］ 需在 105 ℃ 溫度下干燥30 min;油餅［10］ 需在 80 ℃溫度下水浴加熱 30 min 或加無水硫酸鈉等。GB 5009.6－2016 標準規定直接使用無水乙醚，要求對液體或半固體試樣進行干燥處理，對固體樣品沒有要求，簡化了固體試樣的前處理步驟。
3.1.3 制樣細度要求 需要測定脂肪含量的食品種類紛繁復雜，脂肪存在方式各異，GB 5009.6－2016 標準為對樣品細度未做特殊規定，而被替代標準及相關文獻有所規定，一般情況下，肉及肉制品需要在絞肉機內至少攪碎兩次［2－3］ ，部分標準規定需要過 40 目篩子［2］ ，對于糧油產品和食用菌樣品，需要過 1、0.9 mm 圓孔篩子［7－8］ ，對于油料餅粕等脂肪含量高、難以干燥和碾碎的樣品則做了更加細致的規定［10］ 。如果不對樣品細度進行規定，很難保證脂肪抽提的完全性，必然會造成結果的誤差。
3.2 提取劑的選擇
GB 5009.6－2016 標準中索氏提取法和酸水解法使用的抽提劑為無水乙醚或石油醚，堿水解法使用無水乙醚和石油醚進行萃取。標準［7］ 和文獻 ［16］ 中均有說明:不能用石油醚代替乙醚，因為它不能溶解全部的植物油脂類物質。因此，實驗中抽提劑選擇無水乙醚優于石油醚［27］ 。文獻中也有使用正己烷、三氯甲烷－甲醇、二硫化碳等作為提取劑的情況［28－29］ ，但此類試劑毒性較大，未被標準采用。
3.3 干燥溫度
脂肪種類繁多，其中芳香性油脂、揮發性油脂和熱不穩定油脂在脂肪測定中，需要控制干燥至恒重的溫度和時間［29］ ，GB 5009.6－2016 標準規定恒溫條件為95～105 ℃，1 h。相比而言，最高溫度略高、恒重時間略短于其他標準。溫度過低不能達到干燥恒重的效果，溫度過高芳香性油脂、揮發性油脂和熱不穩定油脂等容易揮發損失造成負誤差，如椰子油、棕櫚仁油等，干燥溫度不宜高于 80 ℃，溫度過高，其中的熱不穩定油脂或分解或氧化造成數據失真［29］ ，所以具有揮發性油脂的測定不在 GB 5009.6－2016 標準測定范圍內。因此，建議在分析可能含有芳香性油脂、揮發性油脂和熱不穩定油脂的樣品時，不采用此法。其脂肪的測定，一方面要控制恒重條件，降低溫度，或減少干燥時間，避免芳香性油脂的揮發和損失，可以采用真空干燥箱或惰性氣體保護來干燥;另一方面注意實驗觀察，如果有色澤、氣味上的變化，就應該修改實驗方案。
3.4 驗證提取
食品中脂肪檢測的關鍵控制點在脂肪抽提或者溶出效率，即是否完全將食品中的脂肪轉移到了有機溶劑中［28－29］ 。各標準中索氏提取耗時較長，對于不同的樣品的提取溫度、回流速率及抽提時間也有差異，不同樣品脂肪抽提所采用的標準及建議條件如表 2 所示。
以乙醚為萃取溶劑時，加熱溫度一般為 65～75 ℃。具體溫度，視抽提管中乙醚回流速度而定，一般以 3～5 min 虹吸一次為標準。水浴溫度過高，乙醚流失，導致結果偏低［26］ 。所以驗證提取是否完全成為實驗質控的重要環節。觀察實驗如出現以下三種情況中的一種可以認為提取完全:a.二次抽提，二次抽提產物恒重增量不超過0.1% ［3，5］ ;b.觀察抽提液乙醚滴在毛玻璃片上無油跡殘留［6，8］ ;c.抽提至抽提管內的乙醚用玻璃片檢查無油跡［7］ 。
GB 5009.6－2016 標準采用 b 法，具有較好的操作性和準確性。
3.5 空白試驗
空白實驗一方面可以用于試劑驗收，對于存在非揮發性物質的試劑，GB 5413.3－2010 乳與乳制品脂肪檢測中需要進行空白實驗，以 10 mL 水代替樣品進行測試，得出試劑空白，該值通常小于0.5 mg，在常規測定中，可忽略不計。如果全部試劑空白殘余物大于0.5 mg，則分別蒸餾100 mL 乙醚和石油醚，測定溶劑殘余物的含量，用空的控制瓶測得的殘余量和每種溶劑的殘余物的含量都不應超過 0.5 mg，否則應更換成合格的試劑或對試劑進行提純。另一方面空白實驗還用于驗證抽提效果和環境條件的校準，在 GB 5413.3－2010 中利用無水奶油(1 g)與樣品同時測定，以進行空白試驗，對測量操作和儀器設備進行同步驗證。
在 GB 5009.6－2016 標準中僅對乳及乳制品、嬰幼兒配方食品中脂肪測定的堿水解法做了空白實驗要求，其余樣品及方法未做空白實驗做解釋，可以認為一般情況下脂肪測定不需要做空白實驗，但是在試劑驗收和初次試驗驗證時，還是應進行空白實驗［28－29］ 。
3.6 試劑驗收與回收由于乙醚中含有水分、乙醇等均會干擾脂肪的提取，使得提取物中含有糖類等非脂類成分［4］ ，會引起正誤差。所以 GB 5009.6－2016 標準中規定使用的提取劑為無水乙醚。另一方面乙醚中如含有過氧化物，索氏提取操作容易發生爆炸［4，7，26］ 。實驗室在采購乙醚后，可試試劑品質參照文獻［26］進行除氧化物、除水、除醇、操作。
為提高實驗室環境友好度、降低檢測成本，對脂肪測定中使用過的乙醚可以重復利用，重復利用前［4，7，26］ 可參照文獻方法先做過氧化物檢驗及處理［4，26］ ，再進行脫水處理 ［26］ 。
4 結論與展望
GB 5009.6－2016 標準整合并替代了之前的 9 個國家標準，是測定食品中脂肪含量的國家食品安全強制性標準，為生產企業開展內部質控、檢驗檢測機構和監管機構依法檢測判定等提供了標準依據。但是，該標準也存在一些通用型標準普遍存在的問題，比如標準適用范圍規定不具體，前處理過程描述偏于簡略等問題。而同時又因為食品種類紛繁復雜，脂肪存在形式多樣等特殊情況，所以，檢測人員在實際檢測過程中，必須在深刻理解檢測方法基本原理基礎上，根據樣品的具體特性，細化操作步驟和要求，并通過實驗驗證形成作業指導書，以便更加規范操作過程，保證檢測結果的準確性。